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miRNA图谱分析的新选择

  miRNA谱分析的新选择

  微小RNA(miRNA)是一组天然存在的非编码RNA,在基因调控中发挥重要作用。它们是高度保守的单链RNA(〜22个核苷酸),从更长的发夹前体转录物切割下来。目前已有800多种人类miRNAs被报道,更多的人正在等待实验验证。一系列的研究表明,miRNA参与细胞内的许多过程,包括发育,分化,增殖,凋亡等,自然也与癌症的发展密切相关。为了鉴定差异表达的miRNA,许多研究以整体miRNA表达谱为出发点。目前,miRNA表达谱分析的主要方法之一是利用miRNA芯片在一次全球实验中同时检测多种miRNA的表达和相关性。但事情并不那么简单。 miRNA在生理功能中如此重要以及之前从未被人们所知的原因很大程度上是由于它们体积小,形态低,不稳定,多样性高,同源性高等。只有约22nt的单链RNA分子的丰度非常低,纯化的难度可想而知,特别是在样本量方面有限。由于小分子难以扩展,也增加了样品痕量分析的难度,特别是大量样品的高通量分析----几乎不可能----不可能的任务。 miRNA的定量分析目标锁定也好,miRNA芯片也好,样本量也有一定的要求 - 以芯片为例,通常需要1微克以上的RNA,有的甚至需要10微克。而对于只有几百到几百个样本的单元格来说,这种情况是无法扩大的,芯片有些无奈。在这里,BioTalk引入了一种新的miRNA表达分析方法,不仅可以准确量化miRNA,而且不需要太多样品。 ABI公司的TaqMan MicroRNA Arrays实际上与我们通常的芯片不同,它们更像是TaqMan MicroRNA Assay芯片的整合形式 - 通过分析方法的创新转换,TaqMan分析和实时PCR的特异性,灵敏度和可重复性将金标准引入miRNA的检测和定量,首先看TaqMan MicroRNA Assay ----实际上是RT-qPCR ----它使用逆转录和定量PCR来定量miRNA的表达。但是,请注意,一般来说,仅有22nt RNA短序列模板可用于逆转录。巧妙而创新的设计是Megaplex逆转录引物不是随机引物,而是靶特异性茎环结构的逆转录引物。这种创新的设计解决了miRNA定量的基本问题:成熟miRNA的短序列(〜22nt)不允许在反转录反应中使用传统的随机引物。茎环结构仅为成熟miRNA模板提供特异性,并形成从miRNA的3末端延伸的引物/成熟miRNA嵌合体,所得较长的逆转录酶扩增产物可用作标准实时定量PCR分析的模板这样可以扩增miRNA,一旦扩增问题解决,样本量小,丰度低等问题自然解决,miRNA定量检测和定位分析也迈出了关键的一步。真相很简单,它不是您自己可以合成的引物,所以只能去ABI购买Megaplex Primer Pools提供涵盖人类,老鼠或老鼠的667,518或303种miRNA的Sanger MiRBase v10的全面报道。为了满足已知的miRNA分析的需要,如果您的研究目标是正确的,那么恭喜,其余的工作是非常合乎逻辑的,TaqMan MicroRNA Assay由于扩增更为敏感。搜索者只需要非常少量的总RNA样本即可。 DNA预扩增步骤的引入显着减少了起始RNA样品的量。甚至1ng总RNA产生全面的表达谱(参考文献1)。这样的细胞也可以分析,对临床样本来说绝对是好消息。传统的方法至少需要几百纳克的总RNA。为此创新的放大方法,实验显示可靠---- TaqMan Assay的线性动态范围很宽,可以达到7对数的线性动态范围。在相同的实验中,可以精确定量从几个拷贝到数百万个microRNA靶标的拷贝。鉴于不同细胞,组织类型和疾病状态中miRNA浓度的巨大差异,这可能是一个关键因素。作为用于PCR和荧​​光定量探针(Roche的TaqMan专利持有人)的TaqMan-MGB技术的明确品牌之一,由ABI开发的TaqMan-MGB产品已被视为金标准,因此不难想象,ABI这样的产品会不由自主地走向金标准,需要3个小时才能得到结果,整个miRNA谱可以在5个小时内生成,而且不需要几天时间。 TaqMan检测芯片-TaqMan MicroRNA Arrays,集合了TaqMan MicroRNA Assays的所有优点,并预装入一个方便的微流控芯片格式,非常适合人类,大鼠和小鼠的绘图,其原理实际上是非常简单,即在微流体板中进行384定量PCR反应,每个阵列的内容物与它们各自的Magaplex Primer Pools相匹配,并且包含高达381个独特的TaqMan MicroRNA Assays,有效地减少了设置时间a减少实验的不确定性。 TaqMan Universal PCR Master Mix可以简单地与每个反应混合,并在一天后用Megaplex RT引物逆转录miRNA靶标,并用Megaplex PreAmp引物预扩增后,移动到TaqMan Array的八个加载端口之一。一个工作日内可以生成涵盖Sanger miRBase的综合数据集。每个物种都有一套两套TaqMan MicroRNA芯片。然而,要完成这个实验,7900定量PCR仪器是必不可少的,但也需要TLDA阻断完成。如果你在你附近找不到这个仪器,那么你可以考虑外包。上海生物芯片中心提供相关服务。您只需要提供RNA样品,TaqMan microRNA阵列到生物芯片公司就可以了。几个用户现在已经享受了TaqMan MicroRNA Assay的好处,并在Nature,Cell,Cancer Research的一篇文章中进行了验证。 Lee等采用TaqMan MicroRNA assay和7900HT定量PCR仪,对10种鳞状细胞癌早期增殖和10种正常鳞状上皮miRNA表达谱进行分析,结果显示70个miRNAe的表达存在显着性差异,其中68个上调,2个下调(2)。 Si和其他TaqMan miRNA阵列使用正常的乳腺癌和乳腺癌组织miRNA表达谱进行分析。通过5对配对样本的比较,它们的miR-21表达在癌组织中比在正常组织中高得多(3)。 Resnick等人使用TaqMan阵列比较九个卵巢癌样本和四个正常样本中的miRNA表达差异。 8个miRNA在表达上有显着差异,其中5个上调,3个下调(4)。
 

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